谷氨酰胺合成酶(GS)是细胞中唯一可以从头合成谷氨酰胺的酶,在癌症代谢中扮演着重要角色。GS酶活缺陷突变往往导致严重的代谢疾病甚至是死亡。理解GS酶活降低对生理功能的影响可能为靶向治疗提供新的方向,同时对其内在机制的探索可以为治疗干预开辟新的途径。已报道的GS酶活缺陷突变包括R324C(第324位精氨酸突变为半胱氨酸)和R341C(第341位精氨酸突变为半胱氨酸)等,本研究新发现了GS的另一个酶活缺陷突变位点K241(第241位赖氨酸)。为了探究GS酶活缺陷突变带来的影响,本研究利用双组学技术对GS的酶活缺陷突变R324C和K241R(第241位赖氨酸突变为精氨酸)在肺癌细胞中的功能进行研究,通过对转录组和代谢组数据的整合揭示了GS酶活缺陷突变对一些重要生物过程的显著影响。GS的缺陷突变阻碍了细胞周期和多种氨基酸代谢途径。除了谷氨酰胺合成受到抑制,精氨酸-脯氨酸代谢、甘氨酸-丝氨酸-酪氨酸代谢以及天冬氨酸-谷氨酸-丙氨酸代谢在GS突变的细胞中表现出更强的活力,同时,氨酰-tRNA的生物合成途径也显著被激活。进一步的研究发现,GS酶活缺陷带来氨基酸代谢的改变源自谷氨酸的重新定向和相关代谢酶的表达变化,同时,氨酰-tRNA生物合成的激活源自谷氨酰胺在GS酶活缺陷细胞中带来的能量应激激活了特定蛋白的表达,如转录因子4(ATF4)。此外,细胞表型实验表明,GS酶活缺陷细胞的迁移能力低于野生型细胞。以上结果揭示了GS酶活缺陷突变体细胞中的代谢重编程现象,突出了癌细胞代谢的复杂性和适应性。

胆汁酸(bile acids, BAs)是胆汁的主要成分,在糖脂和胆固醇的代谢中具有重要的意义。大口黑鲈(Micropterus salmoides)和草鱼(Ctenopharyngodon idella)都是我国重要的淡水鱼养殖品种,明确两种鱼胆汁中胆汁酸谱可为该养殖领域提供数据支持。本研究利用超高效液相色谱-三重四极杆质谱开发了一种能同时检测30种胆汁酸的定性定量方法,并应用于大口黑鲈和草鱼胆汁中胆汁酸的种类和含量分析。方法优化了样品处理方法和仪器分析条件。胆汁样本经过离心后吸取上清液,以甲醇为提取溶剂涡旋混匀,经0.22 μm滤膜过滤后上机分析。采用Shim-pack Velox SP-C18色谱柱(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm)进行分离,以0.01%冰乙酸水溶液-乙腈为流动相进行梯度洗脱,柱温50 ℃,进样量2 μL,采用电喷雾离子源(ESI)进行8种正离子、22种负离子的多反应监测(MRM)扫描。结果表明,30种胆汁酸在各自线性范围内线性良好,相关系数(R²)为0.9975~0.9997,回收率为72.3%~117.2%,相对标准偏差为0.46%~13.23%,方法的检出限(LOD)为0.01~0.75 ng/mL,定量限(LOQ)为0.02~2.28 ng/mL。利用所建立的方法对大口黑鲈和草鱼的胆汁进行检测,在大口黑鲈胆汁中成功检测出19种胆汁酸;在草鱼胆汁中成功检测出16种胆汁酸,大口黑鲈胆汁中有5种胆汁酸在草鱼胆汁中未检出,而草鱼胆汁中有2种胆汁酸在大口黑鲈胆汁中未检出。该方法简单快速,灵敏度和精确度高,适用于大口黑鲈和草鱼胆汁中30种胆汁酸的同时检测。

动物源性食品是人体摄入维生素D和25-羟基维生素D的重要食物来源。目前我国相关标准限于维生素D的含量测定,使用非衍生化方法进行检测。本研究以4-苯基-1,2,4-三唑啉-3,5-二酮(PTAD)作为衍生试剂,通过Diels-Alder反应,在维生素D和25-羟基维生素D上引入易电离基团,提高离子化效率,建立了衍生化-超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)同时测定动物源性食品中维生素D和25-羟基维生素D的检测方法。本研究对衍生化条件、样品前处理条件、色谱分离条件和质谱检测条件进行了优化。结果表明,在乙腈溶剂中,目标化合物与衍生试剂PTAD质量比为1∶10000的条件下,衍生反应充分;衍生反应1 h后达到稳定;相较于Silica和C₁₈固相萃取(SPE)柱,HLB SPE柱对目标化合物的回收率更高,同时可有效降低基质效应的影响;在水-甲醇流动相体系中添加5 mmol/L甲胺,可显著提升目标化合物的检测灵敏度。样品经过均质,加入同位素内标,碱液皂化,萃取浓缩,固相萃取柱净化和化学衍生,在Waters Acquity UPLC BEH C₁₈色谱柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm)上,以0.1%甲酸-5 mmol/L甲胺水溶液和0.1%甲酸-5 mmol/L甲胺甲醇溶液作为流动相梯度洗脱。分析物在电喷雾正离子模式(ESI⁺)下进行多反应监测(MRM)测定,内标法定量。结果表明,维生素D和25-羟基维生素D在0.2~50 μg/L内线性良好,相关系数为0.9995~0.9999,方法检出限为0.018~0.066 μg/kg,方法定量限为0.06~0.22 μg/kg,在0.20、1.0、5.0 μg/kg 3个加标水平下,加标回收率为92.6%~99.4%,相对标准偏差为3.6%~6.2%。该方法灵敏度高,重复性好,适用于动物源性食品中维生素D和25-羟基维生素D灵敏、准确的定量检测。

本研究建立了在超净环境下基于二维离子排斥-离子交换色谱配合阀切换技术测定G2级磷酸中痕量阴离子含量的方法。通过比较确定了第一维超纯水流经离子排斥柱的最佳柱流速为0.5 mL/min,并确定阀切换窗口,以尽可能降低PO₄^3-在阴离子富集柱上的富集水平,减小了磷酸基体的干扰;采用抑制器外接水模式,降低了基线噪声;优化了第二维的淋洗程序,实现了痕量目标阴离子的良好分离,避免了硝酸根的假阳性风险。结果表明:Cl^-、Br^-、NO₃^-和SO₄^2- 4种阴离子在0.5~20 μg/kg含量范围内呈现良好的线性关系,相关系数>0.999;检出限和定量限分别为0.09~0.29 μg/kg和0.29~0.97 μg/kg。在4个添加水平下,各阴离子的加标回收率为91.7%~103.6%,RSD为0.1%~4.9%。本方法具有重复进样稳定性好、检出限低的优势,方法的精密度和准确度高,能满足G2级磷酸中痕量阴离子的检测需求。此外,通过单一标准物质保留时间定性,本研究在G2级磷酸中发现除常规阴离子外,可能还存在以亚磷酸根(HPO₃^-)和六偏磷酸根(PO₃^-)₆为代表的其他磷系阴离子和阴离子簇。这一发现对于今后更高纯度磷酸的纯化工艺开发具有一定的理论和应用意义。

建立了一种离子色谱测定人体呼出气和唾液中葡萄糖的方法。通过自制的呼出气冷凝装置和非刺激性方法分别收集人体呼出气和唾液,利用离子色谱对呼出气冷凝液(EBC)和唾液中的葡萄糖含量进行了检测。经过实验优化后,确定最佳冷凝温度为-14 ℃,最佳呼气流量为15 L/min。以Dionex CarboPac MA1离子色谱柱(250 mm×4 mm)为分析柱,柱温为30 ℃;以0.8 mol/L氢氧化钠溶液为流动相,泵流速设置为0.4 mL/min。在此条件下,葡萄糖在0.01~20 mg/L范围内线性关系良好,线性相关系数为0.9999,检出限为2.1 μg/L,定量限为7.0 μg/L。呼出气样品中葡萄糖含量的日内和日间精密度均≤7.5%(n=5),唾液样品中葡萄糖含量的日内和日间精密度均≤7.1%(n=5)。实验结果表明,利用该方法测定的呼出气和唾液中的葡萄糖含量与血糖水平之间均具有较好的线性关系,线性决定系数(R²)分别为0.8431和0.8204。采用该方法对6位糖尿病患者和6位健康受试者呼出气和唾液中的葡萄糖含量分别进行检测,实验结果表明,在空腹状态下,糖尿病患者和健康受试者呼出气中的葡萄糖含量差异并不大,但在口服葡萄糖1 h后,糖尿病患者呼出气中的葡萄糖含量(48.4~140.0 ng/L)比健康受试者(1.7~7.9 ng/L)高6~80倍。在空腹状态下,糖尿病患者唾液中的葡萄糖含量(87.6~158 mg/L)比健康受试者(31.6~70.9 mg/L)高1.2~5.0倍;在口服葡萄糖2 h后,糖尿病患者唾液中的葡萄糖含量(136~257 mg/L)比健康受试者(33.1~75.2 mg/L)高1.8~7.7倍。本方法采样过程简单,精密度好且对人体无副作用,可为其他人体代谢物的检测提供技术支撑。

全氟烷基和多氟烷基化合物(PFASs)因其持久性、毒性和容易富集等特点,成为国内外广泛关注的一类新污染物。开展人体内PFASs的生物监测和暴露评估对于评估这些化学物质对人体健康的风险具有重要意义。因此亟需开发准确灵敏、方便快捷的检测方法。本研究采用自制的不需要活化、平衡的直通式HMR固相萃取柱净化样本,结合超高效液相色谱-串联质谱(UHPLC-MS/MS),建立了血清中17种PFASs的检测方法。50 μL血清样本在HMR固相萃取柱中用400 μL乙腈提取(每次200 μL)并净化2次后,使用Poroshell 120 EC-C18色谱柱(100 mm×3 mm, 2.7 μm)分离,以5 mmol/L乙酸铵水溶液和甲醇为流动相进行梯度洗脱,ESI^-离子源电离,采用多反应监测模式检测,同位素内标法定量。结果表明,17种PFASs在相应质量浓度范围内线性关系良好(r²>0.995),检出限为3.6~14 ng/L,定量限为11~42 ng/L。血清样本加标回收率为89.3%~110.2%,日内相对标准偏差(RSD)为2.5%~9.8%,日间RSD为3.6%~10.2%。将方法应用于20份人体血清样品的检测,结果显示17种化合物均有检出。本方法仅需50 μL血清样品,可以在HMR固相萃取柱中一步实现提取和净化,且固相萃取过程可以实现与96孔板的适配。方法操作简便,灵敏度高,样本用量少,检测效率高,适用于人群血清样本中PFASs的大规模监测及暴露评估。

本研究建立了超高效液相色谱-串联质谱法同时检测植物源性食品中环氧虫啶和哌虫啶2个非对映异构体残留量的分析方法,优化了干制水果和茶叶等基质的提取方式,确定了净化填料C₁₈、PSA、GCB和无水硫酸镁的最佳用量。样品经乙腈提取,氯化钠盐析分层,采用基质分散固相萃取净化,经ACQUITY UPLC BEH C₁₈色谱柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm)分离,外标法定量。结果表明:环氧虫啶和哌虫啶在各自范围内呈良好的线性关系,相关系数均大于0.99,该方法的定量限为0.01 mg/kg,满足GB 2763-2021和GB 2763.1-2022规定的限量要求。用建立的方法对植物源性食品(稻谷、糙米、小麦、大米、花生、葡萄干、甘蓝、生菜、四季豆、西红柿、土豆、香菇、苹果、柑橘和茶叶等)进行加标回收验证,结果表明:15种基质在定量限1倍、2倍、10倍或GB 2763限量水平的加标平均回收率为78%~110%, RSD为0~12.8%。用本方法对100批果蔬样品进行分析检测,结果显示,环氧虫啶和哌虫啶均未检出。该方法前处理简单,普适性强,可作为植物源性食品中环氧虫啶和哌虫啶的确证定量检测方法。

建立了同时测定化妆品和牙膏中玻色因、木糖醇、山梨醇、甘露醇、蔗糖、肌醇等6种多羟基化合物的方法。水可分散样品和水包油样品用水提取,提取液再经乙酸乙酯和正己烷洗涤;油包水样品先用乙酸乙酯预分散,再用水提取,最后提取液经正己烷洗涤。提取液经Ultimate XB-NH₂柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)分离,乙腈-水溶液梯度洗脱,蒸发光散射检测器检测,外标法定量。分别对提取过程和色谱条件等进行了优化。在优化的实验条件下,6种多羟基化合物在0.2~5.0 g/L范围内线性关系良好,相关系数为0.991~0.996;方法的检出限(LOD, S/N=3)和定量限(LOQ, S/N=10)分别为0.10%和0.35%。针对水包油、油包水的化妆品和牙膏基质,进行了低、中、高3个水平的加标回收试验,目标物的平均回收率为84.7%~94.1%,相对标准偏差(RSD, n=6)为2.2%~6.9%。该方法具有经济简便、稳定可靠、重复性好等优势,适用于化妆品中多羟基化合物的检测。

开放性实验课程是培养本科生实践能力、创新思维和团队协作精神的重要手段。本项目基于超高效液相色谱-串联质谱法(UHPLC-MS/MS)在蛋白质组前沿领域的研究,设计了一个本科生开放性实验,即基于UHPLC-MS/MS完成甲状腺癌组织切片蛋白质组定量分析。首先,评价不同蛋白质裂解液对蛋白质的提取能力,以筛选适当的试剂用于蛋白质组样品预处理,可培养学生的动手能力和科研思维。其次,优化液相色谱-质谱采集方法,实现蛋白质组的深度覆盖分析,加深学生对于液相色谱-质谱技术的认识。最后,将该方法用于石蜡包埋甲状腺乳头状癌组织切片样品蛋白质组定量分析,发现了33个差异蛋白质,展示出在疾病分型方面的应用潜力。该开放性实验将仪器分析、分析化学和生物化学三门课程理论与实验相关知识交叉融合在一起,将科研思路和创新理念渗透给本科生。以进行大型仪器操作和创新性实验的形式帮助学生拓展巩固理论知识,有助于学生形成系统化知识体系,增强其对相关领域知识的整体把握,激发本科生科学研究的兴趣,开拓创新思维,增加团队合作精神。

针对课程思政案例易重复,以及课程思政考评难的问题,本文以仪器分析实验中的经典实验高效液相色谱法为例,介绍了结合课程特点开展课程思政的教学实践。实验的具体内容为测定食品中的防腐剂和甜味剂;普适性和专属性两类课程思政案例的具体实践过程,包括案例意义、案例导入、案例实施、案例拓展和效果考核,普适性案例以仪器分析实验的重要性为例,专属性案例以高效液相色谱仪的国产化之路为例。此外,阐述了在仪器分析实验课程内,根据课程进度和学生实际情况,适时调整课程思政的内容,分阶段融入课程思政的重要性。除了价值引领和思想教育的功能,本文同时强化了课程思政在促进专业知识学习和创新能力培养方面的作用,并主张通过专业知识的掌握和创新能力的提高来评价课程思政的效果。

“高山仰止,方知才疏。”为进一步推动新课程标准的落地,本文设计了一个仪器分析综合型实验用于本科生仪器分析实验教学。代谢组学是继基因组学和蛋白质组学之后发展起来的新兴组学技术,是系统生物学的重要组成部分。本论文以了解代谢组学在环境与健康领域中的重要应用为目的,通过查阅文献和分组讨论的环节确定本实验选取的用于镓元素分离富集的样品前处理技术及检测方法。随后,让学生通过实验分析了添加金属抗癌镓类药物后培养的细胞中代谢产物的含量变化,进一步引导学生理解代谢组学在环境与健康领域的广泛应用。本实验结合代谢组学在生理药理学中的重要作用,以X射线光电子能谱仪和热重分析仪等大型精密仪器辅助材料的表征,以电感耦合等离子体质谱法对细胞代谢产物中的金属镓元素进行定性与定量分析。本综合实验由教师选题并引导学生综合利用大型仪器去解决问题,做到以研促教,教研相长,为今后常态化地打造仪器分析综合型实验的高效课堂打下坚实基础。