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近期色谱研究亮点
康经武
2010, 28 (3):
223-224.
1一种高灵敏的微流芯片电泳的检测方法
发展高灵敏的微流芯片电泳检测技术一直是人们关注的一个焦点。最近,广西师范大学赵书林教授领导的课题组发展了一种基于化学发光共振能量转移(CRET)的高灵敏微流芯片检测方法。他们发现,一些有机化合物(如氨基酸、有机酸、甾体、生物胺和有机硫化物)会抑制鲁米诺和CdTe量子点之间的共振能量转移,从而降低样品区带内的荧光,产生类似间接荧光检测的倒置的电泳谱图。相比于电化学和激光诱导荧光检测,他们发展的检测方法具有操作更简单、灵敏度更高(提高10到1000倍)、通用性更好等特点,且不需要荧光标记。该方法的检测灵敏度可以满足单个血红细胞中9种氨基酸的检测。详见:Anal Chem, 2010, 82: 2036－2041。
2黄蜂蜘蛛性外激素的气相色谱-质谱(GC-MS)鉴定
色谱在生命科学研究中起着越来越重要的作用，对昆虫性外激素的研究即是一例。昆虫性外激素大多数是几种小分子有机化合物组成的混合物。昆虫在交配季节会释放特定组成和含量的性外激素,诱导异性前来约会。不同种类的昆虫之间从不会出现信息传递和解读的错误。这非常类似于人类发明的通讯密码。这种现象使科学家感到非常困惑。最近,德国的两个科学家Gabriel Uhl和Stefan Schulz领导的研究团队合作借助于顶空采样技术和GC-MS技术揭开了黄蜂蜘蛛的性外激素的秘密。他们将雌性的蜘蛛放在玻璃盒内,用活性炭作为吸附剂富集黄蜂蜘蛛在未成熟期、处女期和交尾后3个阶段所释放的挥发性化学物质,用GC-MS分析经二氯甲烷洗脱富集的挥发性物质。对比蜘蛛在这3个阶段所释放出的挥发性物质,他们推测蜘蛛在处女期强烈释放出的化合物A,即甲基柠檬酸三甲酯,很可能就是性外激素。进一步的分析表明化合物A实际上是按照一定比例组成的甲基柠檬酸三甲酯的两个非对映异构体。他们用手性GC柱确定了这两个非对映异构体的绝对构象为2R, 3S和2S, 3S。进一步由不对称合成得到了2R, 3S和2S, 3S这两个异构体,并按6∶1的比例配制成人工的性外激素,结果在野外成功地诱捕到了雄性的黄蜂蜘蛛。这一研究为昆虫性外激素的研究提供了一条有效的途径。详见:Angew Chem Int Ed, 2010, 49: 2033－2036。
3薄层色谱(TLC)的新故事
尽管高效液相色谱风行天下,但作为经典色谱技术之一的薄层色谱仍然被作为一种非常简便、廉价的分离分析工具而受到有机化学家的青睐。事实上,薄层色谱技术的发展并非停止不前,超薄层色谱(ultra-thin-layer chromatography, UTLC)的出现即是一例。UTLC能在只有10 μm厚的整体硅胶层上实现快速高效的分离,在结构上非常容易实现二维分离,或与基质辅助激光解吸飞行时间质谱仪(MALDI-TOF MS)联用。但是,用常规的薄层扫描色谱仪的点样器很难点出足够小的样品点以实现高的分离效率;另外,由于超薄层板是半透明的,如果点样的斑点太小,则又很难被薄层色谱检测器检测。最近,德国和加拿大科学家合作发表的论文讲述了他们是如何利用办公室喷墨打印机和扫描仪很好地解决UTLC的点样和检测的问题。他们使用一台能够在CD盘上打印的佳能Bubble Jet打印机,将混合的食品色素溶液放入空的打印墨盒中,用绘画软件画好设定大小的斑点,由喷墨打印机将斑点打印到UTLC板上;拿出点好样的薄层板,在普通的TLC仪器上展开后,板面朝下放入扫描仪中,通过扫描仪的扫描就可以方便地检测分离结果。实验结果表明,用喷墨打印机和扫描仪在点样精度和检测灵敏度方面大大优于常规的薄层色谱扫描仪的电喷嘴和影像系统。详见:Anal Chem, Publication Date (Web): February 15, 2010， DOI: 10.1021/ac902945t。
另一篇关于在薄层板上实现快速二维色谱分离工作的论文是由加州大学伯克利分校的Svec教授和北京大学的刘虎威教授课题组合作完成的。他们在4.0 cm×3.3 cm的玻璃板上通过光引发聚合制成50 μm厚的整块的超疏水性聚合物层。通过在聚合前遮挡一小部分的光照,就可以在玻璃板上预留一个600 μm宽的通道。以2-丙烯酰氨基-2-甲基-1-丙烷磺酸作为单体,通过光接枝聚合法修饰这一通道后,就能用来做第一维的离子交换色谱分离。由于巨大的表面张力差异,水相流动相被限定在第一维通道内,而整体超疏水性聚合物层可以作为第二维反相色谱的分离介质。他们用一组多肽混合物验证了这一快速二维分离设想的实用性。实验中,研究者采用了紫外光可视化和解吸电喷雾离子化-质谱两种检测技术。这样的实验设计为多维薄层色谱分离技术的发展提供了新思路。详见:Anal Chem, 2010, 82: 2520－2528。
4高通量的top-down蛋白质鉴定方法
在蛋白质组学研究中,有两种方法被用来鉴定复杂的混合蛋白质样品。一种方法是bottom-up(自下而上)方法,即先用蛋白质水解酶将蛋白质混合物消解成混合的多肽片段,再采用液相色谱-串联质谱分析;另一种方法是top-down(自上而下)方法,该方法不需要用酶水解蛋白质,可直接采用质谱裂解技术鉴定出完整的蛋白质结构。前一种方法已经被广为使用,但第二种方法由于缺少能够分离和检测完整蛋白质的高通量技术而仍然处于发展的初期。最近,Illinois大学的Neil Kelleher及其同事提供了一种基于纳升级液相色谱-质谱(nano-LC-MS)的高通量鉴定完整蛋白质的top-down方法。首先,他们建立了全蛋白质的nano-LC-MS线性离子阱质谱分离测定方法。他们发现,使用聚苯乙烯柱可以在0.3 pmol水平上分辨出用来测试的所有的7种蛋白质,而使用硅胶C4柱只能分辨出其中的4种蛋
白质。使用聚苯乙烯柱分离蛋白质获得的质谱检测的信噪比是反相硅胶柱的2～3倍。作者还发现聚苯乙烯填料的孔径大小会显著影响全蛋白质的分离效果。相对于小孔径的填料,孔径为100 nm (1000 )的聚苯乙烯填料能够使相对分子质量(Mr)分布范围很宽的蛋白质获得更好的分离,得到更高的柱效。由于线性离子阱质谱具有更快的扫描速度和更高的信噪比,因此作者选用离子阱质谱而非傅里叶变换离子回旋共振质谱(FTICR-MS)来进行蛋白质的Mr测定。由于在离子阱内无法选择Mr巨大的蛋白质的电荷状态,也就无法采用碰撞诱发的裂解碎片化方式。因此,作者采用NSD(Nozzle-Skimmer Dissociation)碎片化技术使蛋白质裂解,从而获得高分辨的蛋白质碎片的质谱结果。为了能够用于实际样品中蛋白质的测定,研究者采用8通道的GELFrEETM系统对从酵母细胞或人HeLa S3细胞中提取的蛋白质混合物进行预分离,从而将Mr为10000到100000的蛋白质分成了32个组分,然后采用建立好的nano-LC-MS方法对不同Mr范围的蛋白质组分进行分析测定。另外,还可以采用二维电泳获得更高分离度的预分离。研究者相信他们的技术可以达到与bottom-up方法相当的分析通量。这一工作展示了全蛋白质高通量鉴定的可行性。详见:Anal Chem, 2010, 82: 1234-1244。
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